発現系構築 組換え蛋白質
発現プラスミド構築
目的cDNA／遺伝子を制限酵素処理またはPCRにより、ご指定の発現ベクターへ連結し、発現プラスミドを作製いたします。
得られた発現プラスミドはDNAシーケンス解析（制限酵素処理の場合は連結部位、PCRの場合はインサート全長）を行い、確認いたします。
PCRにより塩基置換・ 欠失が確認された場合は、お客様のご要望に応じて、修正作業も行います。
| ご提供いただくもの | 目的cDNA／遺伝子が挿入されたプラスミドDNA およびその塩基配列情報、指定ベクター |
|---|
大腸菌
構築した発現プラスミドを宿主へ遺伝子導入し、抗生物質に対する感受性／栄養要求性を利用し、組換え体を選択いたします。
得られた組換え体を小スケールで培養し、組換え蛋白の産生を確認いたします。
さらに大量調製が必要な場合は、得られた結果に基づき大量培養を実施します。
また、ご要望に応じて組換え蛋白の精製も承ります。
| ご提供いただくもの | 発現プラスミド、宿主菌株 | |
|---|---|---|
| 基本作業・期間 | 1．形質転換 2．小スケール培養 3．分析 |
（1週～） |
バキュロウイルスを用いた昆虫細胞
構築した発現プラスミドを昆虫細胞にトランスフェクションし、組換えウイルスを作製いたします。
宿主細胞（Sf9、Sf21、その他）にウイルスを感染させ、組換え蛋白の発現条件を検討します。得られた至適条件にて組換え蛋白を調製いたします。
組換え蛋白の精製をご要望の場合は、1L分の培養上清または感染細胞を精製原材料として調製後、トライアル精製を実施させていただきます。
なお、組換え蛋白の精製に関しましては、各種タグ等によるアフィニティ精製によるワンステップを基本として承ります。
タグ付加のない場合はお問合せください。
| ご提供いただくもの | 発現プラスミドまたはトランスファーベクター | ||
|---|---|---|---|
| 基本作業・期間 | 1．トランスフェクション 2．組換え蛋白の発現確認 3．ウイルス液の増幅 4．タイター測定 5．培養条件の検討 6．1Lスケールの培養 7．トライアル精製 8．組換え蛋白の大量調整 |
1週 1週～ 1週 2週 1週～ 2週～ 2週～ 2週～ |
（10週～） |
哺乳動物細胞（安定型）
構築した発現プラスミドをCHO、 HEK293などの哺乳動物細胞株にトランスフェクションし、薬剤選択後、20クローン程度をクローニングいたします。RT-PCRやウェスタンブロッティングなどの手法により導入遺伝子の転写産物または組換え蛋白の産生を確認いたします。発現の良好なクローンを標準3クローンまで選択し、凍結細胞を作製・納品いたします。
| ご提供いただくもの | 発現プラスミド、宿主細胞株 | ||
|---|---|---|---|
| 基本作業・期間 | 1．トランスフェクション 2．薬剤耐性株のクローニング 3．発現確認 4．拡大培養 5．凍結バイアルの作製 |
2週 4週 2週～ 1週 1週 |
（10週～） |
哺乳動物細胞（一過性）
構築した発現ベクターをCOS1やCOS7、HEK293などにトランスフェクションし、培養上清もしくは細胞内に発現した組換え蛋白を回収いたします。
ご要望に応じて組換え蛋白の精製も承ります。
| ご提供いただくもの | 発現プラスミド、宿主細胞株 | ||
|---|---|---|---|
| 基本作業・期間 | 1．トランスフェクション条件の検討 2．トランスフェクション 3．培養上清もしくは細胞の回収、分析 |
4週 2週～ 1週 |
（7週～） |
